光滑爪蟾 中國專利：抗菌肽與革蘭陰性菌外膜的抗菌活性

【技術領域】

[0001] 本發明涉及藥物化學技術領域，具體涉及一種非洲爪蟾皮膚抗菌肽及其制備方法和用途。

【背景技術】

[0002] 抗菌肽，又稱抗微生物肽，是由免疫系統釋放的具有抗菌活性的物質。 它們作為先天免疫成分的一部分廣泛存在于自然界的生物體中。 抗菌肽是具有廣泛生物活性的小分子多肽，包括殺菌、抗炎、抗病毒、抑制腫瘤等作用。 它們是生物非特異性防御??系統的重要組成部分。 抗菌肽具有廣譜抗菌活性，能與革蘭氏陰性菌外膜上的脂多糖和革蘭氏陽性菌表面的肽聚糖結合，從而破壞細胞膜，形成跨膜通道，引起細胞滲漏內容物或離子流出。 高滲破裂死亡后，不易產生耐藥性。 因此，抗菌肽作為生物活性高、不易產生耐藥性的小分子肽，具有極其廣泛的應用價值。

[0003] 兩棲動物裸露的皮膚與生活環境直接接觸，沒有鱗片、甲殼和毛發的保護。 然而，在兩棲動物的皮膚表面，往往會覆蓋有粘液物質，形成保護屏障。 這種屏障含有大量結構相對復雜的大分子物質和功能多樣的抗菌活性物質。 抗菌肽作為成分，發揮著重要作用。

抗菌肽作為抗菌藥物的研究已經廣泛而深入。 其中，小分子抗菌肽的研究成果尤為顯著。 小分子抗菌肽不僅具有高效的抗菌活性，而且由于其分子結構簡單，合成成本較低。 、沒有免疫反應等優點。 在公開號為103641901A的中國專利中，公開了一種序列為GLPLLI SWIKRKRQQAGPGSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM的抗菌肽。 在公開號為102140130A的中國專利中，公開了一種序列為KCRRRKVHGPMIRIRKK的抗菌肽。 上述兩種抗菌肽的序列和二級結構較長，導致其合成困難且成本較高。 在公開號為103524602A的中國專利中，公開了一種序列為RRRffffC的6肽抗菌肽。 但該發明僅闡明了其病毒活性，并沒有闡明其抗腫瘤等其他作用，而且該專利也沒有對這種抗菌肽進行研究。 該肽的溶血活性極大地限制了其應用。

[發明內容]

本發明要解決的技術問題是提供一種滑爪蟾皮膚抗菌肽及其制備方法和用途。

本發明解決現有技術中存在的技術問題所采用的技術方案是：本發明的滑爪蟾皮抗菌肽由4分子天冬氨酸和1分子谷氨酸組成，序列為Asp - Glu-Asp-Asp-Asp 是 DEDDD 的 5 肽。

本發明還可以采用以下技術措施：本發明的爪蟾皮膚抗菌肽由4分子天冬氨酸和1分子谷氨酸組成，序列為Asp-Glu-Asp-Asp-Asp，即DEDDD 5肽，其分子量為607.7Da。

本發明的光爪蟾皮膚抗菌肽的制備方法，包括以下步驟： A、提取光爪蟾皮膚分泌物； B.制備型高效液相色譜分離純化； C.制備液相分離峰進行活性檢測； D.分析高效液相色譜分離純化； E.分析液相分離峰的活性檢測和質譜鑒定。

[0017] 所述步驟A中，物理刺激非洲爪蟾皮膚后得到非洲爪蟾皮膚分泌物。

[0010] 所述的物理刺激為恒壓電刺激，電壓為15-20V。

本發明的爪蟾皮膚抗菌肽在制備抗菌藥物中的應用。

[0012] 本發明的爪蟾皮膚抗菌肽在制備細菌引起的抗菌藥物中的應用。

[0013] 本發明的光爪蟾皮膚抗菌肽在制備抗腫瘤藥物中的應用。

[0014] 本發明的爪蟾皮膚抗菌肽在制備治療乳腺癌的藥物中的應用。

本發明的優點和積極效果是：本發明采用物理方法刺激皮膚，極大地保護了抗菌肽的結構完整性和生物活性。 其次，本發明公開的抗菌肽為小分子肽，有利于皮膚吸收，大大降低了化學合成的難度和成本，增強了其應用的可能性。 最后，本發明的抗菌肽抗菌活性顯著，溶血活性低，抗乳腺癌細胞活性良好，無毒副作用，不易產生耐藥性，大大增強了應用范圍。 基于上述優點，本發明提供的抗菌肽可以應用于工業化生產。

【圖片說明】

圖1為本發明爪蟾皮膚抗菌肽的色譜圖； 圖2為本發明非洲爪蟾皮膚抗菌肽的質譜圖； 圖3為本發明爪蟾皮膚抗菌肽的固相合成色譜圖； 圖4為本發明光爪蟾抗菌肽的固相合成質譜圖； 圖5為本發明光爪蟾抗菌肽在不同濃度下的溶血率； 圖6為本發明光爪蟾抗菌肽在不同濃度下對乳腺癌細胞MCF-7的抑制率。

【詳細方式】

本發明的非洲爪蟾皮膚抗菌肽由4分子天冬氨酸和1分子谷氨酸組成，序列為Asp-Glu-Asp-Asp-Asp，即DEDDD的5個肽，其分子分子量為607. 7Da，命名為XLAsp-Pl。

1.本發明的非洲爪蟾皮膚抗菌肽是通過以下方法制備的： 1. 1.獲取非洲爪蟾皮膚分泌物。 取100只非洲爪蟾，用蒸餾水清洗皮膚表面，去除雜質。 使用15V直流電間歇性刺激皮膚表面，誘導皮膚分泌。 約10分鐘后，可見皮膚分泌更多無色透明物質，其中夾雜著白色粘液狀物質。 使用15-20V之間的直流電壓即可達到上述分泌效果。 用超純水收集分泌物，12000rpm離心15min，除去沉淀，取上清液。 上清液經0.45 μm濾膜過濾后，用10 KDa超濾管以12,000 rpm離心20 min，去除大分子蛋白。 采用金黃色葡萄球菌ATCC29213檢測粗提物的抗菌活性。 使用冷凍干燥機濃縮粗提取物，然后儲存在-40°C。

1.2 制備型高效液相色譜分離純化半制備型C18柱與儀器連接，流動相A（上樣緩沖液，水+0.05%TFA）、B（洗脫緩沖液，乙腈+0.05%TFA）儀器的泵。 調整儀器，用液體A平衡系統，直至吸收值達到平衡。 然后設置自動進樣量為2mL/次，自動采集程序為2min/管，流速為2mL/min。 并根據預實驗的結果，設定洗脫程序，如下表1所示。 多次上樣，同時混合各組分，然后濃縮。

1. 3 液相分離峰活性檢測的制備以金黃色葡萄球菌S. aureusATCC29213為活性檢測用菌株，采用藥敏片法體外檢測分離峰活性。 將菌液稀釋至0.5麥克法蘭濁度后，取100ML，涂于直徑90mm的細菌培養皿中。 待風干時，將各分離峰制成的藥敏片貼在瓊脂表面，37℃溫熱。 在盒子中孵育過夜，并根據抑制區的存在和大小確定分離峰的活性和強度。 活性分離峰將被進一步分離。 1.4 分析型高效液相色譜分離純化為了確定各個活性峰中的活性物質，并獲得純度較高的樣品，以方便測序實驗，我們采用分析型高效液相色譜（Analytical High Performance Liquid Chromatography，分析型HPLC）儀器進一步分離活性峰。 首先將分析型C18柱連接到儀器上，并將流動相A（上樣緩沖液，水+0.05%TFA）、B（洗脫緩沖液，乙腈+0.05%TFA）連接到儀器的泵上。 相應地。 調試儀器，分別吹掃泵A和泵B，并用液體A平衡系統，直至吸收值達到平衡。 設置流速為1mL/min，手動上樣100uL/次，根據吸收峰手動采集。 多次加載樣品，合并相同的峰并濃縮。 洗脫程序設置如表2所示，不同樣品根據第一次洗脫效果改變洗脫程序。

1.5 液相分離峰分析活性檢測和質譜鑒定活性檢測方法同1.3。 使用MALDI-TOF/TOF質譜儀鑒定具有抗菌活性的分離峰，包括分子量和純度。 首先，將 1 μL 分離的樣品和肽標準品分別點樣在拋光的靶標上。 風干后，將1 μL飽和α-CCA基質（溶劑：0.1%三氟乙酸+50%乙腈）添加到樣品表面，自然干燥。 MALDL-T0F/T0F采用正離子和自動采集模式來收集數據。 首先，使用肽標準品進行校準，并將質量掃描范圍設置為0-4KDa，以獲得樣品的初級質譜。 通過分析質譜，可以獲得更高純度（高達95%）的成分，用于氨基酸序列的測定。 最后分離出符合要求的4-9峰抗菌肽，其色譜圖和質譜圖如圖1和圖2所示。

2、光爪蟾皮膚抗菌肽氨基酸序列的測定是通過分離純化、質譜鑒定，對符合測序要求的抗菌肽進行氨基酸測序。 ABI491氨基酸序列分析儀的原理是Edman降解法：首先將異硫氰酸苯酯與多肽的N端殘基偶聯，形成苯氨基硫代羧基肽（PTC-肽）； 然后PTC-肽發生環化裂解反應，形成噻唑烷酮苯胺氨基酸（ATZ-AA）； 最后，經過轉化反應，ATZ-AA轉化為苯基異硫脲氨基酸(PTH-AA)。 通過比較微梯度輸送系統（毛細管HPLC）與標準PTH-AA的保留時間，利用數據分析軟件獲得抗菌肽的氨基酸序列。

3、光爪蟾皮膚抗菌肽序列的生物信息學分析對生物信息學數據庫NCBI()和Antimicrobial PeptideDatabase(APD)兩大數據庫進行檢索和比較，確定獲得的光爪蟾皮膚抗菌肽序列。 與任何已知序列都不同，因此可以判斷

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