斑馬魚仔魚中性粒細胞炎癥疾病模型研究研究進展

關鍵詞：斑馬魚中性粒細胞炎癥性疾病模型

簡介：中性粒細胞是人類最豐富的白細胞，在抵抗感染的第一道防線中發揮著至關重要的作用。 此外，中性粒細胞發育或功能缺陷是許多嚴重免疫缺陷的原因。 中性粒細胞功能障礙也與各種炎癥病理有關。 近年來，人們認識到，除了經典定義的微生物殺傷功能（即吞噬作用、脫顆粒和壞死）之外，中性粒細胞還通過產生細胞因子以及與其他免疫和非免疫細胞相互作用來發揮多種功能。免疫細胞。 細胞功能。 最近的證據表明，中性粒細胞可以根據其微環境表達不同的表型。 此外，單細胞基因表達技術揭示了健康和疾病中的多個中性粒細胞亞群。 在通過免疫基因組（免疫基因組）項目對健康或發炎組織中的中性粒細胞進行的新分析中，研究人員提出，在健康條件下，來自多個組織的所有中性粒細胞狀態都可以投射到一個稱為“連續體”的連續體上。 根據來源組織和所使用的炎癥刺激，來自發炎組織的中性粒細胞會偏離形成新的簇，這凸顯了組織微環境在調節中性粒細胞表型和功能中的重要性。 因此，中性粒細胞功能最好在體內組織微環境中研究。 在過去的二十年中，斑馬魚已被廣泛用作生物醫學研究模型來闡明疾病機制，這很大程度上歸功于胚胎透明性和可用的遺傳工具。 成年斑馬魚的免疫系統十分發達，其功能性T細胞和B細胞譜系與哺乳動物相當，而受精后3-4周，幼魚的先天免疫系統主要由巨噬細胞和中性粒細胞組成。 自2006年首次報道帶有熒光標記中性粒細胞的斑馬魚以來，斑馬魚幼體模型已被廣泛用于研究中性粒細胞在感染、炎癥、組織修復和癌癥中的功能。 例如，中性粒細胞的反向遷移有助于緩解炎癥，實驗室首先在幼蟲尾鰭創傷模型中進行了描述，后來在小鼠身上得到了證實。 中性粒細胞反向遷移現在被認為是炎癥消退的一個重要方面，并且可能是炎癥信號傳播到遠處器官的機制。

斑馬魚幼蟲中性粒細胞的形態特征表明它們可能是一個異質群體，其亞群可能不是完全成熟的中性粒細胞。 因此，在選擇斑馬魚幼體模型來研究特定疾病機制時，需要仔細考慮斑馬魚幼體中性粒細胞與哺乳動物中性粒細胞的異同。 我們回顧了斑馬魚幼蟲中性粒細胞發育和功能的數據，特別注意在哺乳動物中性粒細胞系統中建立最接近的對應物。 根據目前的證據，我們將討論斑馬魚幼蟲為推進中性粒細胞生物學提供的機會。

斑馬魚幼蟲中性粒細胞的起源和壽命：在哺乳動物中，中性粒細胞由造血干細胞 (HSC) 的粒細胞祖細胞在骨髓 (BM) 中產生。 成熟的中性粒細胞不斷釋放到血液中，循環中的中性粒細胞通過遷移對炎癥信號作出反應，即離開血流進入組織微環境執行多種功能。 在斑馬魚幼蟲中，中性粒細胞是由原始造血和最終造血產生的。 原始造血發生在受精后 24 小時內 (hpf)。 隨后，后血島 (PBI) 中產生源自紅系骨髓祖細胞 (EMP) 的中性粒細胞。 使用髓過氧化物酶 (mpo) 作為泛中性粒細胞標記，蘇丹黑 (SB) 染色作為成熟中性粒細胞標記，在 24 hpf 時僅檢測到 mpo+/SB- 未成熟中性粒細胞。 ，而第一個成熟的SB+中性粒細胞可以在35hpf時檢測到。 在穩態條件下，到 48 hpf 時，所有中性粒細胞均為 mpo 和 SB 雙陽性斑馬魚繁殖周期及過程，表明它們處于完全成熟狀態。 中性粒細胞在受精后 2-3 天 (dpf) 時開始由位于背主動脈 (VDA) 腹壁的 HSC 產生，VDA 相當于哺乳動物的主動脈-性腺-中腎 (AGM)。 HSC 遷移到尾部造血組織（CHT，胎兒肝臟的哺乳動物對應物），并成為幼蟲發育過程中中性粒細胞產生的主要部位。 VDA 和 CHT 產生的中性粒細胞被稱為“幼蟲粒細胞”，以區別于原始中性粒細胞，并且被認為與成體造血產生的中性粒細胞相似。 到 5 dpf 時，HSC 到達腎骨髓，在動物的整個生命周期中，中性粒細胞由 HSC 衍生的祖細胞產生，這一過程類似于哺乳動物的骨髓造血。

圖 1：斑馬魚中性粒細胞發育。

樂等人。 使用譜系追蹤仔細分析了 48 hpf 時粒細胞的起源，并證明了初級和最終 CHT 起源的中性粒細胞的共存。 有趣的是，在48hpf-72hpf之間，雖然原始骨髓祖細胞不再存在，但在缺乏確定造血功能的突變幼蟲中，原始衍生的成熟中性粒細胞的數量翻倍，這表明成熟的Naive中性粒細胞保持增殖直至3dpf，或者有更多未成熟的中性粒細胞達到成熟度在 2-3 dpf 之間。 哺乳動物中性粒細胞增殖尚未被描述。 有趣的是，在中性粒細胞中，細胞周期標記被激活，表明有能力在成熟的中性粒細胞中啟動有絲分裂信號。 由于原始中性粒細胞僅在 48 hpf 之前的短時間內產生，因此這些細胞的壽命決定了它們在幼蟲中的持久性。 使用光轉換熒光蛋白標記和測量 3 dpf 時斑馬魚幼蟲組織中中性粒細胞半衰期的研究證據表明，幼蟲組織中中性粒細胞的壽命為 5 天。 然而，在整個測量過程中，標記細胞的數量并未增加，這就提出了幼稚中性粒細胞在超過 3 dpf 后是否仍保持增殖潛力的問題。 然而，在幼蟲生命的第一周，原始中性粒細胞可能持續存在于幼蟲組織中。 由于大多數使用斑馬魚幼蟲來研究中性粒細胞功能的研究都是在這個時間范圍內進行的，因此研究人員將研究混合原始和最終衍生的中性粒細胞群體的功能，盡管沒有證據表明原始中性粒細胞在功能上不同于從中性粒細胞產生的中性粒細胞。它們最終是派生出來的。 骨髓中循環中性粒細胞的假定半衰期僅為 6-12 小時，但在人體中則長達 5 天。 人們認為人體組織中的中性粒細胞壽命更長，但這很難測量。 大多數離開斑馬魚幼蟲造血部位的中性粒細胞存在于組織中，只有少數存在于循環中。 在斑馬魚幼蟲中測量的中性粒細胞壽命可能反映了在哺乳動物系統中看到的類似條件。 這表明幼蟲斑馬魚中性粒細胞與哺乳動物組織中性粒細胞相當。 在哺乳動物中，中性粒細胞的產生因炎癥信號傳導的增加而增強。 所有現有的中性粒細胞在對抗細菌的過程中都會死亡，HSC 衍生的中性粒細胞過量產生，增強炎癥信號和抗菌功能。 因此，這將斑馬魚幼蟲作為研究調節需求驅動的粒細胞生成的機制以及感染后組織中中性粒細胞募集功能的相關模型。

斑馬魚幼蟲中性粒細胞的核形態特征和成熟：中性粒細胞是快速移動的細胞，可以通過非常狹窄（~1μm）的內皮通道遷移到組織中，這也可以在斑馬魚幼蟲到達時觀察到。 這需要細胞直徑和核形態的動態變形，這是通過核膜的特定組成來實現的。 多形核是人類和小鼠成熟中性粒細胞的特征，在斑馬魚中性粒細胞中也可見。

成年斑馬魚的腎臟和脾臟含有處于不同發育階段的中性粒細胞，包括具有大而圓形核和彌漫核染色質的早幼粒細胞，以及具有2或3葉的成熟分葉狀核。 中性粒細胞。 在斑馬魚幼體中，大多數中性粒細胞具有腎形細胞核，約15-25%具有雙葉細胞核，少數具有多葉細胞核。 這些形態特征表明許多幼蟲中性粒細胞是不成熟的，然而，尚未對 2-5 dpf 之間的幼蟲中性粒細胞系統地進行核形態與其他成熟標記（例如蘇丹黑信號）的直接比較。 相關性研究。 由于基因操作的簡便性，可以在斑馬魚中探索調節中性粒細胞發育和成熟的機制。 與哺乳動物相比，斑馬魚中涉及中性粒細胞發育的關鍵途徑是保守的，許多研究都將分析重點放在造血發育過程中產生的中性粒細胞的比例。 幼蟲生命前 48 小時內原始中性粒細胞的發育獨立于 HSC，這為揭示 HSC 經典轉錄因子 Runx1、cmyb 和 Cebp1 在中性粒細胞成熟中的功能作用提供了機會。 中性粒細胞成熟表型被評估為改變的核形態或中性粒細胞顆粒形成。 除了已知的中性粒細胞成熟相關基因外，還發現了新的調節因子。 廉等人。 研究表明，5-氨基乙酰丙酸合酶 1 (ALAS1) 是血紅素生物合成途徑的關鍵酶，是中性粒細胞成熟和正常功能所必需的。 Wu等人的研究表明，在Gfiaa突變魚中，中性粒細胞祖細胞過度增殖和擴張，導致從幼魚階段開始就積累了具有腎形細胞核的未成熟中性粒細胞。 相反，miR-142-3p的缺失導致中性粒細胞數量減少，但胚胎中中性粒細胞成熟度增加，更多的中性粒細胞具有雙葉或多葉細胞核。 這些中性粒細胞在遷移至炎癥部位方面也存在缺陷。 班克斯等人。 表明表觀轉錄組機制可能通過 Tet 蛋白調節中性粒細胞成熟，Tet 蛋白使 mRNA 去甲基化，導致其降解。 Tet2/3 突變導致細胞因子信號傳導受到抑制，包括 JAK/STAT 信號傳導，從而導致 3dpf 幼蟲和成年斑馬魚中性粒細胞顆粒化和吞噬作用缺陷，但仍能正常遷移到傷口中。 盡管如此，這些研究表明，高分葉中性粒細胞遷移能力較差，但吞噬功能正常，而低分葉中性粒細胞在顆粒化和吞噬功能方面存在缺陷，但具有良好的遷移能力。 有一些證據表明哺乳動物中性粒細胞的核形態和功能之間存在類似的聯系，但直接針對所有這些特性的研究仍然有限且尚無定論。 斑馬魚為實時成像提供了出色的遺傳工具和特性，從而有助于剖析相關體內環境中中性粒細胞核形態、遷移和功能之間的關系。

斑馬魚幼蟲中性粒細胞的功能特征：斑馬魚幼蟲已被廣泛用于模擬各種人類炎癥病理，包括病毒、細菌和真菌感染、創傷和癌癥。 這使得研究中性粒細胞生物學的幾個功能方面成為可能，包括吞噬作用、壞死、遷移和炎癥消退，揭示了人類和斑馬魚之間保守的功能機制以及一些新的發現，從而突出了斑馬魚幼蟲作為研究模型的相關性體內中性粒細胞的功能。

中性粒細胞效應功能：通過吞噬作用清除病原體和受損組織對于宿主防御和組織修復至關重要。 熒光轉基因報告魚線還攜帶熒光標記細菌，能夠對體內感染和傷口愈合過程中的中性粒細胞吞噬作用進行實時成像。 -Guyon 等人證明，中性粒細胞是直接反應者并吞噬體腔中表面相關的微生物，而巨噬細胞是清除血液中病原體的主要參與者。 幾個例子表明，斑馬魚幼蟲的中性粒細胞吞噬作用對于感染控制至關重要。 然而，在某些情況下，中性粒細胞不會殺死吞噬的細菌，而是可以為細菌傳播提供細胞內生態位。 在斑馬魚幼蟲的無菌組織損傷中也觀察到中性粒細胞的吞噬行為，例如傷口和腫瘤發生； 然而，這種行為的功能后果尚不清楚。 中性粒細胞脫顆粒和活性氧產生是吞噬細胞內或細胞外病原體清除的兩個主要效應功能。 例如，幼蟲斑馬魚中性粒細胞可以吞噬并利用 NADPH 氧化酶來殺死受感染巨噬細胞中的分枝桿菌。 據報道，中性粒細胞在志賀氏菌感染中具有類似的清除作用。 Phan 等人已經證明，中性粒細胞還可以利用氧化機制在不直接接觸的情況下消除病原體。 在大腸桿菌脊索感染模型中。

中性粒細胞胞外陷阱 (NET)：成熟激活的中性粒細胞的防御功能之一是釋放中性粒細胞胞外陷阱 (NET)，它是由 DNA、組蛋白和顆粒蛋白組成的纖維結構。 。 除了純粹的抗菌功能外，在哺乳動物中，NET 已被證明在各種生理條件下發揮作用，例如癌癥和心血管疾病。 有報道稱，成年魚和斑馬魚幼蟲在受到創傷和細菌或真菌感染后會形成NET。 在斑馬魚幼蟲中，NET 的形成與群體反應中早期中性粒細胞 DNA 的釋放有關。 人類中性粒細胞對白色念珠菌反應的體外測試也存在類似的聯系。 在感染的情況下，中性粒細胞焦亡似乎參與其中，并且是有效清除斑馬魚幼蟲中細菌或真菌病原體所必需的。 因此，斑馬魚可以進一步作為模型來研究各種病理炎癥條件下的功能，以確定斑馬魚的NETs是否與哺乳動物的NETs在功能上同源。 因此，幼蟲斑馬魚中性粒細胞似乎概括了哺乳動物對應物在防御病原體方面的大部分功能。 然而，不同造血波產生的中性粒細胞可能存在的功能差異仍然難以捉摸。 如果沒有區分不同成熟度的中性粒細胞的明確報告，確定成熟與未成熟中性粒細胞的功能貢獻也是一個挑戰。 一般來說，斑馬魚幼蟲在 1-2 dpf 后，隨著中性粒細胞的分化，其抵抗感染的能力變得更強。

中性粒細胞的募集及其在傷口愈合和再生中的作用：中性粒細胞是高度移動的細胞，雖然哺乳動物模型中的體內成像設備正在改進，但透明斑馬魚幼蟲已經廣泛用于研究中性粒細胞遷移到損傷部位和隨后的解決炎癥的發生稱為逆向遷移。 斑馬魚幼蟲受傷后，首先通過傷口釋放的趨化信號從鄰近組織招募中性粒細胞。 相比之下，在人類中，中性粒細胞從骨髓中動員起來是罕見的事件。 在穩定狀態下，大多數成熟的中性粒細胞保留在 BM 中。 另一方面，即使在沒有炎癥的情況下，中性粒細胞也會滲透到組織中，這表明它們在維持組織穩態方面發揮著作用。 然而，組織中性粒細胞的作用以及調節其募集和保留的機制尚未完全了解。 斑馬魚幼蟲中的中性粒細胞主要駐留在組織中，從而為研究中性粒細胞在組織中的遷移和功能提供了機會。 尾鰭損傷測定已廣泛用于研究調節中性粒細胞趨化遷移的信號，最近還用于表征中性粒細胞聚集。 嗜中性粒細胞募集到損傷組織中可分為三個階段(1)單個嗜中性粒細胞初始趨化至損傷部位，隨后(2)遠處嗜中性粒細胞趨化性增強，導致(3)嗜中性粒細胞積累。 對哺乳動物模型的研究表明，由于有效的旁分泌信號，中性粒細胞的募集既是一個自我放大又是自我限制的過程，使中性粒細胞有時間在募集和防御模式之間切換。 斑馬魚體內成像研究表明，到達壞死組織的中性粒細胞可以感知損傷信號ATP，從而觸發一波鈣警報信號。 該信號以接觸依賴性方式通過連接蛋白 43 (Cx43) 半通道傳播，觸發化學引誘信號的合成。 近年來，中性粒細胞在組織修復中的功能備受關注。 盡管需要更多的研究來充分闡明中性粒細胞在不同組織修復過程中的功能作用，但中性粒細胞似乎通過調節受損組織內的多種細胞類型來發揮其促修復功能。 因此，使用標記中性粒細胞和其他相關細胞的多個報告基因來研究中性粒細胞如何與局部組織內的不同細胞類型相互作用將是有利的。

腫瘤中的中性粒細胞功能：中性粒細胞是各種腫瘤和腫瘤微環境中最常見的炎癥細胞類型，即使在早期階段也是如此，其高腫瘤內密度通常與不良預后相關。 腫瘤相關中性粒細胞 (TAN) 被分類為促炎抗腫瘤 N1 或促腫瘤 N2，IFNβ 和 TGFβ 被認為是決定其表型的關鍵因素。 然而，在癌癥中，在血液和組織中發現了表現出一系列成熟狀態的中性粒細胞，并且它們的成熟度和功能之間的聯系仍然知之甚少。 轉基因斑馬魚腫瘤模型的研究揭示了對轉化細胞的早期炎癥反應，表明中性粒細胞迅速被各種組織中的轉化細胞吸引，包括皮膚、肝臟和大腦。 此外，涉及中性粒細胞耗竭或抑制的研究表明，這些細胞在腫瘤發生過程中具有促進腫瘤的作用，盡管有助于結直腸癌異種移植模型中的腫瘤清除。 與哺乳動物數據一致，即使在腫瘤發生期間，TGF-β似乎也能吸引中性粒細胞進入轉化的肝細胞并促進免疫抑制。 在哺乳動物和斑馬魚中，參與中性粒細胞向傷口和炎癥部位募集的多種細胞因子和其他介質也介導中性粒細胞向轉化細胞和腫瘤微環境 (TME) 募集，包括 TNFα、IFN1、CXCR1 和 CXCR2 受體、IL8和H2O2。 此外，斑馬魚中性粒細胞響應轉化細胞表達多種免疫抑制和營養基因，炎癥介質前列腺素 E2 (PGE2) 由中性粒細胞亞群產生。 后一個發現表明，斑馬魚中性粒細胞可以對轉化細胞產生異質反應，盡管迄今為止，在斑馬魚腫瘤模型中尚未定義不同的中性粒細胞亞群。 許多中性粒細胞對轉化細胞的反應似乎在哺乳動物和魚類之間是保守的。

結論和展望：在過去的十年中，斑馬魚幼蟲模型為我們理解感染、炎癥、組織損傷和癌癥中中性粒細胞功能的調節機制做出了重大貢獻。 斑馬魚和哺乳動物中性粒細胞的個體發育和成熟途徑之間存在同源性。 斑馬魚幼蟲為研究正常和病理組織條件下的中性粒細胞功能提供了理想的模型。 此外，斑馬魚幼蟲的大量繁殖數量和較小的體型為抗炎藥物的體內系統藥物篩選提供了機會。 使用多宿主免疫細胞和病原體標記物對感染模型進行詳細的體內成像分析和轉錄組分析，將有助于深入了解宿主/病原體相互作用中中性粒細胞功能的調節機制。 原始中性粒細胞在斑馬魚幼蟲出生后第一周持續存在，目前它們與最終的造血中性粒細胞無法區分，并且可能有助于斑馬魚幼蟲模型中描述的中性粒細胞功能。 迄今為止，主要通過耗竭或抑制中性粒細胞募集到發炎組織中來研究中性粒細胞在疾病模型中的功能。 在過去的幾年中，中性粒細胞特異性/CAS9基因編輯系統進一步豐富了研究斑馬魚體內中性粒細胞功能的工具箱，使得研究中性粒細胞中的個體基因功能成為可能。 與疾病模型相比，在健康條件下對幼蟲和成體中性粒細胞進行單細胞 RNA-seq 分析將成為斑馬魚中性粒細胞生物學的寶貴資源。 無創體內活體成像是使用斑馬魚幼蟲模型的優勢之一。 無創體內實時成像是使用斑馬魚幼蟲模型的優勢之一。 未來幾年，更多工具將進一步增強斑馬魚幼體模型研究組織中性粒細胞功能的能力。

原文來自：by 留學——

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